一種用于穿透多肽篩選的隨機(jī)文庫(kù)的構(gòu)建及篩選

以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)為示蹤物,在pET-14b載體上構(gòu)建編碼12個(gè)氨基酸的隨機(jī)多肽表達(dá)文庫(kù).建立一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效的文庫(kù)篩選方法,從所構(gòu)建的文庫(kù)中篩選出細(xì)胞穿透多肽(cell-penetrating peptide,CPP).采用點(diǎn)突變技術(shù),首先在pET-14b載體多克隆位點(diǎn)Nde Ⅰ和Xho Ⅰ之間加入4個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),隨后在BamHⅠ位點(diǎn)后加入三聯(lián)終止密碼子,接著再利用亞克隆的方法在Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ之間插入EGFP,形成一個(gè)新的用于原核表達(dá)示蹤蛋白的載體pET-14bMCStop/EGFP.最后再利用點(diǎn)突變技術(shù)在上述構(gòu)建的示蹤載體的多克隆位點(diǎn)XhoⅠ和BamH Ⅰ之間插入36個(gè)隨機(jī)堿基序列.以His-Tat-EGFP作為工具建立有效的篩選方法,利用這種方法對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選.酶切和測(cè)序表明,示蹤載體的構(gòu)建是正確的,且在大腸桿菌中可有效地表達(dá)出His標(biāo)記的EGFP.在示蹤載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建的隨機(jī)多肽文庫(kù)至少包含了105個(gè)獨(dú)立克隆,其中90%以上的克隆插入的隨機(jī)片段都是36個(gè)堿基.建立的篩選方法是可行的,并用此方法進(jìn)行了初步的篩選.

作 者： 劉瑜 劉亞偉 李海玉 劉靖華 鄧鵬 姜勇 LIU Yu LIU Ya-Wei LI Hai-Yu LIU Jing-Hua DENG Peng JIANG Yong   作者單位： 南方醫(yī)科大學(xué)廣東省功能蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和病理生理學(xué)教研室,廣州,510515  刊 名： 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)  ISTIC PKU 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY  年，卷(期)： 2006 22(6)  分類號(hào)： Q2  關(guān)鍵詞： 細(xì)胞穿透多肽   隨機(jī)多肽文庫(kù)   跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)   內(nèi)化  

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