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蛋白質(zhì)含量測定方法的比較
第３１卷第４期２００８年０４月Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．４Ａｐｒ．２００８第一文庫網(wǎng)
蛋白質(zhì)含量測定方法的比較
郭穎娜，孫
（華北制藥股份有限公司，河北
［摘
衛(wèi)
石家莊
０５００２７）
存在和進化都密切相關(guān)，蛋白質(zhì)含量測定涉及到生產(chǎn)和科研的眾多領(lǐng)域。目前常用的方法有要］蛋白質(zhì)與生命的起源、
凱氏定氮法、雙縮脲法（Ｂｉｕｒｅｔ）、紫外吸收法、考馬斯亮藍法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）。本文總結(jié)各種方法的特點及適用條件，針對不同的待測樣品以及對測定結(jié)果準確性的要求不同，我們可以采用不同的方法來測定樣品中蛋白質(zhì)的含量。
［關(guān)鍵詞］蛋白質(zhì)；凱氏定氮法；雙縮脲法；紫外吸收法；考馬斯亮藍法［中圖分類號］ＴＳ２１２．７
［文獻標識碼］Ａ
［文章編號］１００３－５０９５（２００８）０４－００３６－０２
蛋白質(zhì)含量測定方法，是生物化學(xué)研究中最常
用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法（Ｂｉｕｒｅｔ）、紫外吸收法、考馬斯亮藍法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）。其中Ｂｒａｄｆｏｒｄ法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏１０～２０倍，比Ｂｉｕｒｅｔ法靈敏１００倍以上。凱氏定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標準蛋白質(zhì)。這４種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，每種方法都有其優(yōu)缺點，在選擇方法時應(yīng)考慮：⑴實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；⑵蛋白質(zhì)的性質(zhì)；⑶溶液中存在的干擾物質(zhì)；⑷測定所要花費的時間。
１凱氏定氮法１．１原理
凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定４個過程。其原理是樣品中含氮有機化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化，含氮有機物分解產(chǎn)生氨，氨又與硫酸作用，變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨，氨用過量的硼酸溶液吸收，再用鹽酸標準溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。１．２特點
凱氏定氮法是目前分析有機化合物含氮量常用的方法，是測定試樣中總有機氮最準確和最簡單的方法之一，被國際國內(nèi)作為法定的標準檢驗方法。凱氏定氮法樣品的最佳消化條件為硫酸銅２．５０ｇ，硫酸鉀０．１０ｇ，濃硫酸４．００ｍＬ；硫酸銅的用量為影響消化時間的主要因素，硫酸鉀和濃硫酸用量為第二和第三主要因素；用此最佳條件做實驗，消化時間僅為
［收稿日期］２００８－０２－１３
［作者簡介］
郭穎娜（１９７９－），女，助理工程師，從事質(zhì)檢工作。
１２ｍｉｎ；與其他硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸用量方法對比，該法所需消化時間最短，試劑用量減少，可降低實驗成本，也降低了對環(huán)境的污染。
凱氏定氮法適用范圍廣泛，測定結(jié)果準確，重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜費時，試劑消耗量大。若采用模塊式消化爐代替?zhèn)鹘y(tǒng)的消化裝置，可同時測定幾份樣品，節(jié)省時間，提高了工作效率，適用于批量蛋白質(zhì)的測定，具有準確、快速、簡便、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點。２雙縮脲法（Ｂｉｕｒｅｔ）２．１原理
雙縮脲（ＮＨ３ＣＯＮＨＣＯＮＨ３）是兩個分子脲經(jīng)１８０℃左右加熱，放出１個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與ＣｕＳＯ４形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能夠以１個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。２．２特點
雙縮脲法中樣品的取用量對測定結(jié)果的準確性有顯著影響，采用０．５ｇ樣品，４０ｍＬ雙縮脲試劑的比例具有較高的檢測精度。雙縮脲法對不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，不受溫度的影響�？煽焖贉y定蛋白質(zhì)含量，試劑單一，方法簡便，但靈敏度差，測定范圍為１～２０ｍｇ蛋白質(zhì)。適用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定，常用于谷物蛋白質(zhì)含量測定。３紫外吸收法３．１原理
蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性
第４期郭穎娜孫衛(wèi)：蛋白質(zhì)含量測定方法的比較?３７?
質(zhì)，吸收峰在２８０ｎｍ處，其吸光度（即光密度值）與蛋
白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在２３８ｎｍ的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。３．２特點
最常用的紫外吸收法是２８０ｎｍ的光吸收法，含有核酸的蛋白質(zhì)溶液使用２８０和２６０ｎｍ的吸收差法較好。蛋白質(zhì)的稀溶液采用２１５與２２５ｎｍ的吸收差法。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定，測定后仍能回收使用。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。
缺點是測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，干擾物質(zhì)較多，在用標準曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)有一定的誤差，故該法適于用測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。核酸在紫外區(qū)也有強吸收，但通過校正可以消除。但是因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因ｐＨ的改變而有變化，因此要注意溶液的ｐＨ值，測定樣品時的ｐＨ要與測定標準曲線的ｐＨ相一致。４考馬斯亮藍法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）４．１原理
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的�？捡R斯亮藍是一種有機染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基結(jié)合后變?yōu)樗{色，其最大吸收波長從４６５ｎｍ變?yōu)椋担梗担睿�，蛋白質(zhì)在１～１０００μｇ范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)－色素結(jié)合物在５９５ｎｍ波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。
４．２特點
考馬斯亮藍Ｇ－２５０與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速而穩(wěn)定，２ｍｉｎ左右即達到平衡，其結(jié)合物室溫下１ｈ內(nèi)保持穩(wěn)定，且在５～２０ｍｉｎ之間，顏色的穩(wěn)定性最好。該法方法簡便，易于操作，所用試劑較少，顯色劑易于配制。干擾物質(zhì)少，如糖、緩沖液、還原劑和絡(luò)合劑等均不影響顯色。此法的缺點是由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Ｂｒａｄｆｏｒｄ法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用γ－球蛋白為標準蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Ｂｅｅｒ定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。該方法適用于要求靈敏度高、快速定量測定微量蛋白質(zhì)的測定。５結(jié)語
４種蛋白質(zhì)測定方法比較如表１所示。
表１
方法
靈敏度
蛋白質(zhì)測定方法的比較
時間
原理
說明
量的準確測定；干
凱氏定靈敏度低，適用于氮法
０．２～１．０ｍｇ
費時，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為氮，用于標準蛋白質(zhì)含８～１０ｈ用酸吸收后滴定。擾少；費時太長。
用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋
２＋
８～１０ｈＣｕ→紫色絡(luò)合物。白質(zhì)顯色相似。
雙縮靈敏度低，適用于中速，脲法
１～２０ｍｇ
多肽鍵＋堿性
紫外吸較為靈敏，收法
５０～１００μｇ
用于層析柱流出
和色氨酸殘基在液的檢測；核酸的
５～１０ｍｉｎ２８０ｎｍ處的光吸收。吸收可以校正。最好的方法；干擾物質(zhì)
白質(zhì)結(jié)合時，λｍａｘ由少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺
５～１５ｍｉｎ４６５ｎｍ變?yōu)椋担梗担睿�。隨蛋白質(zhì)不同而變化。
快速，蛋白質(zhì)中的酪氨酸
考馬斯靈敏度最高，亮籃法１～５μｇ
快速，考馬斯亮藍染料與蛋
［參
２００６，（２）：１３２－１３４．
考文獻］
［１］李寧．幾種蛋白質(zhì)測定方法的比較［Ｊ］．山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，［２］李存富．關(guān)于蛋白質(zhì)測定中幾個問題的理論分析與討論［Ｊ］．中國釀造，２００４，（９）：２９－３０．
侯彩云．稻米蛋白質(zhì)測定方法的比較與分析［Ｊ］．食品科技，［３］孫建平，２００５，７８－８１．
張庭芳，李令媛，等．生化實驗方法和技術(shù)［Ｍ］．北京：高等教［４］張龍翔，
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劉坤，李珊．食品中蛋白質(zhì)含量測定方法的改進和應(yīng)用［５］劉玉蘭，
［Ｊ］．青島醫(yī)學(xué)院學(xué)報，１９９９．
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