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膜蛋白的提取與分離
膜蛋白的提取與分離
膜蛋白的分離
一、簡介：
1細胞質(zhì)膜資料
1895年,Overton從研究細胞透性得出"細胞膜由連續(xù)的脂類物質(zhì)組成"。
1925年Gorter&Grendel:用脂單分子膜技術(shù)測定細胞膜中脂分子的總面積，提出："細胞膜是由雙層脂分子組成"。
1935年Danielli&Davson：從測定膜的表面張力得出細胞膜的"三明治結(jié)構(gòu)模型"，即蛋白質(zhì)－脂-蛋白質(zhì)。
1959年Robertson:用電鏡觀察生物膜提出"單位膜模型"，將膜的分子結(jié)構(gòu)與超微機構(gòu)統(tǒng)一起來
厚度：2(暗)+3.5(亮)+2（暗）=7.5
細胞質(zhì)膜的主要功能概括如下：
(1)為細胞的生命活動提供相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境;
(2)選擇性的物質(zhì)運輸，包括代謝底物的輸入與代謝產(chǎn)物的排除，其中伴隨著能量的傳遞；
(3)提供細胞識別位點，并完成細胞內(nèi)外信息跨膜傳遞；
(4)為多種酶提供結(jié)合位點，使酶促反應(yīng)高效而有序地進行；
(5)介導細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間的連接;
質(zhì)膜參與形成具有不同功能的細胞表面特化結(jié)構(gòu)。
2膜蛋白
雖動物細胞主要有9種膜脂，而膜蛋白的種類繁多，多數(shù)膜蛋白分子數(shù)目較少，但卻賦予細胞膜非常重要的生物學功能。
根據(jù)膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結(jié)合方式，膜蛋白可分為兩大類型：外在膜蛋白、內(nèi)在膜蛋白。
(1)外在膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，因此只要改變?nèi)芤旱碾x子強度甚至提高溫度就可以從膜上分離下來，膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。
(2)內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常緊密，一般講只有用去垢劑(detergent)使膜解后才可分離出來。
獲得大量有生物學活性的質(zhì)膜蛋白對我們顯得非常的重要
。
附注：使用分級抽提方法獲得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具備多跨膜區(qū)的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前為止，仍然是蛋白組學的一個瓶頸，不管采用２－Ｄ技術(shù)也好，ＩＣＡＴ乃至proein microarray都還不能有效解決這一問題。
二、蛋白抽提
談及蛋白分離，我們想到：超速離心，鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法……有時這些方法常常組合到一起對特定的物質(zhì)進行分離純化。由于蛋白質(zhì)種類繁多，不同的蛋白質(zhì)由于結(jié)構(gòu)和組成的差異，其溶解度也各不相同.根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解特性，同時可選擇不同的溶劑提取，分為水溶液提取和有機溶劑提取.
但是針對膜蛋白的提取與細胞質(zhì)蛋白，核蛋白提取不同之處在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的離心速度去掉胞質(zhì)蛋白等，最后用去污劑把蛋白從膜中釋放出來。膜蛋白分離純化的重要步驟是選擇適當?shù)脑鋈苡帽砻婊钚詣�，一般常用的有膽酸鹽，CHAPS(一種離子去污劑），Emulgen和Lubrol等表面活性劑。
1、分離膜蛋白的方法（原則性）：
1）先分離膜，然后提�。蝗邕x用冷熱交替法、反復(fù)凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細胞破碎，然后通過剃度離心得到含有膜蛋白的粗組分。（例如：michael11液氮研磨組織，加入勻漿緩沖液及蛋白酶抑制劑。差速離心。蔗糖密度梯度離心。收集37%與41%間的成分，即為質(zhì)膜部分。裂解即可收集膜蛋白）
2）用特殊的去污劑選擇性的分離。從膜上提取蛋白有許多困難.在多數(shù)情況下，都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶解下來，然后
將蛋白質(zhì)穩(wěn)定.去垢劑的選擇通常是依據(jù)他對所需要蛋白質(zhì)的提取效率來確定，但在某些情況下，還要考慮到以后的純化步驟.雖然許多膜蛋白必須在去垢劑存在的情況下進行純化，但最終仍可能需要除去去垢劑.這常常會引起蛋白質(zhì)失活，但如果蛋白質(zhì)是用于測序的，他將不是一個問題.如果不是用于測序的，可考慮使用能夠黏附去垢劑的疏水珠.許多文獻和生化試劑供應(yīng)商的產(chǎn)品目錄中，都介紹有許多種不同的可用來溶解膜蛋白的去垢劑.然而，他們并不是普遍適用的.在設(shè)計膜蛋白溶解方案時，必須考慮某一去垢劑的特殊性質(zhì).如triton X-100在280nm處有吸收，如果某蛋白質(zhì)的測試與280nm處的吸收有關(guān)，就應(yīng)避免使用這類去垢劑.
將膜制劑與胞質(zhì)蛋白及細胞核分離后，再進一步從細胞膜制劑中將所需的膜蛋白增溶下來.這種做法的好處是可以用強烈的去垢劑提取細胞骨架的相關(guān)蛋白，而無需考慮胞質(zhì)蛋白、細胞核成分或染色質(zhì)成分的混入.使用這種方法所獲得的膜蛋白，無論在種類上還是數(shù)量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（<5000Da）要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白總量的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，無疑對于研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能都是非常重要的.第二種方法簡單，可靠，但有時含有其他蛋白。一般的都是利用4度時所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于TritonX114水溶液，在溫度超過20度時，此溶液分為水相和去污相；此時親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。利用此性質(zhì)可提取膜蛋白。
3 )膜蛋白色譜(Chromatography of Membrane Protein,CMP)CMP+分
離強疏水性蛋白、多肽混合物的層析系統(tǒng)，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團（P-端），又具有陽離子鈣（C-端），與固定相結(jié)合主要決定于膜蛋白的大小、SDS結(jié)合量有關(guān)。利用原子散射法研究cAMP的分離機制發(fā)現(xiàn)，樣品與SDS結(jié)合后在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達到分級分離的目的。
層析柱提取（參步驟）
三、
4)順序抽提法：根據(jù)細胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進行抽提的方法。用Tris堿溶液裂解細胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的pellet用標準液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白。
5)centrifugal protein extraction.
離心的
原理：高滲的蛋白裂解液讓細胞溶漲破裂后，超高速離心
評價：盡管分級(胞漿和胞膜)之間有清洗的步驟,但是可溶蛋白組分和膜蛋白組分之間仍然有不少重復(fù)的點.該方法相較MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上發(fā)表的分級抽提法減去了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(極難溶蛋白),在操作上也作了簡化,總而言之是一種不錯的方法。（codegreen）
6)detergent- based：提取時先裂解液裂胞膜（選用不同的去污試劑是關(guān)鍵），梯度離心分離細胞器(ER)，然后分級抽提方法。例如，去掉細胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜時不溶的部分。
總的感受：細胞的量要很充足。之后的定性鑒定常用的方法有雙向免
疫擴散、免疫電泳及聚丙稀酰胺凝膠電泳等。純化蛋白質(zhì)濃度的定量測定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸收法定量鑒定膜蛋白，方便迅速。
到目前為止，提取膜蛋白仍然是蛋白學的一個瓶頸。
2、分離膜蛋白的方法（操作）
1）分離細胞膜蛋白的方法：
1冰上刮下細胞后將細胞溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液A中，于室溫與液氮罐中反復(fù)凍融2次。
2 5000轉(zhuǎn)4度離心，驅(qū)除核及未裂解的細胞。
3取上清12000轉(zhuǎn)4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液B中。
4 12000轉(zhuǎn)4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液C中提取后測蛋白濃度,SDS-PAGE電泳，分裝后-20度保存?zhèn)溆谩?/p>
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)
buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA
buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),
2）分離細胞膜蛋白的方法：
1、細胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細胞兩次
2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
3、刮下單層細胞，4度下10 000g 5min離心
4、溶液37度水浴10min以分離水相和去污劑相，然后37度下2 000g離心5min
5、收集水相留作分析
6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污劑相沉淀，冰浴2min后加溫，在按步驟6再次離心
7、按步驟8再次抽提去污劑相，用buffer C將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積
8、用等量的buffer A分別稀釋水相與去污相，并進行免疫沉淀實驗 試劑：
1、2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制劑
2、緩沖液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）
3、buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
3）分離細胞膜蛋白的方法：
7M urea
2M thiourea
4%chaps
2.5%sb3-10
1000000個細胞，可用此buffer 1ml。冰浴勻漿。冰上置30分鐘。 4度高速低溫離心30min。
取上清-20保存。
4）分離組織膜蛋白的方法：
1、取組織，加入10ml Buffer A于冰上充分勻漿。
2、J6-HC離心機800rpm，4℃離心10min后，所得上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。
3、100000g，4℃離心1hr。棄去上清，沉淀用適量的Buffer B重懸，冰上孵育2hr后分裝至EP管，Eppendorf臺式離心機10000rpm，4℃離心30min。
4、收集所得上清液即為膜組份。
Buffer A：0.32M蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上預(yù)冷。
Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上預(yù)冷。
5）分離組織膜蛋白的方法：
RIPA
1XPBS
1%NP40
0.5去氧膽酸鈉
0.1%SDS
以下用時加入
10mg/ml PMSF異丙醇（終濃度10ul/ml）
Aprotinin（30ul/ml）
1000mM Sodium Orthovandate（10ul/ml）
冰凍組織100mg/細胞1000000個，可用RIPA buffer 1ml。冰浴勻漿。冰上置30分鐘。
4度高速離心30min，20000轉(zhuǎn)低溫離心最佳。
取上清-20保存。
6）分離細菌膜蛋白的方法：
①于20ml營養(yǎng)肉湯中過夜培養(yǎng)細菌，37℃，200rpm。
②10000g、20min、4℃離心，去上清。
③20ml預(yù)冷的Tris-Mg緩沖液重懸，同樣條件離心，再重懸于預(yù)冷的Tris-Mg緩沖液。
④超聲波破碎細菌。
⑤3000g，10min、室溫下離心去除未破碎細菌。小心吸取上清（含有胞質(zhì)成分和細菌外被成分）。
⑥超速離心I：100,000g，60min，4℃，去除上清（胞質(zhì)成分），收集細菌外被成分。
⑦用10ml含2％的SLS的Tris-Mg緩沖液重懸沉淀物，室溫溫育20-30min。
⑧超速離心II：70,000g，60min，室溫沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含細胞質(zhì)膜）。重復(fù)⑦、⑧兩步。
⑨充分吸除上清，并根據(jù)沉淀體積大小用0.1-0.2 ml的ddH2O重懸沉淀物。根據(jù)公式：蛋白濃度(mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260測定外膜蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度至40ug/ul，該蛋白質(zhì)樣品-70℃貯存。 試劑
①Tris-Mg緩沖液
10mM Tris-Cl
5mM MgCl2
pH 7.3，4℃保存
②2%(w/v)十二烷基肌氨酸鈉(SLS)
7）來源于Methods Enzymology (1974)
1.取一定量酶處理的細胞，用勻漿器破碎，操作要溫和，使細胞膜保持完整。由于水與膜的疏水部分之間有反應(yīng)，因此要精確掌握分離介
質(zhì)中的離心強度和滲透壓，以每克細胞濕重加40ml介質(zhì)。
2．用Potter-Elvehiem勻漿器，桿與壁間間隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下勻漿4～6次，每次5S。
3．過濾勻漿液，150g離心10min，保留上清，沉淀部分加入50μl介質(zhì)，用勻漿器1kr/min勻漿3次，150g離心10min，沉淀部分再加入上次勻漿的上清液。
4．合并3次上清液，2kg離心10min，棄上清，沉淀部分溶于100μl介質(zhì)，離心10min，棄上清，留沉淀。
5．將沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分別置于三個離心管中，上面依次疊加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。
6．700kg離心90min，分離介質(zhì)在1.16～1.18之間形成介面。
7．收集d為1.16～1.18g/ml之間的細胞膜，加30倍的介質(zhì)以2.5kg離心10min，洗滌2次。
8．保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5緩沖液中，用于細胞膜的研究分析
8）常用的制備粗制質(zhì)膜組分的方法：（所有操作都在4攝氏度下進行）
1.在冰冷的勻漿緩沖液中切碎組織塊，倒出血水。用勻漿緩沖液漂洗組織碎塊，并將它們置于冰上，重復(fù)上述操作，直至組織碎成1mm3大小的碎片，且無可見的血。
2.加入5倍（體積比）與組織塊體積的緩沖液，再置于冰浴的Dounce
氏玻璃勻漿器中，抽研10-20次，勻漿組織。
3.勻漿4攝氏度600g離心10min，上清含細胞膜、線粒體和細胞溶膠。沉淀中有未破碎的細胞及細胞核。棄沉淀。
4.上清4攝氏度8000g離心10min，沉淀線粒體。棄沉淀。
5.上清4攝氏度10000g離心20min，棄上清。
6.用勻漿緩沖液重懸沉淀，繼續(xù)勻漿，再次4攝氏度，10000g離心20min，棄上清。
7.用小體積的適宜緩沖液重新徹底勻漿沉淀。
8.粗制的樣品可于干冰/乙醇中速凍，保存于-80攝氏度。
9）用特殊的去污劑選擇性的分離。簡單，可靠，但有時含有其他蛋白。 原理：4度時所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于TritonX114水溶液，但在37度時，此溶液分為水相和去污相；此時親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。
方案
1、放射性標記受試細胞
2、將標記的細胞放在冰上
3、去除上清，用pH7。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細胞兩次
4、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
5、刮下單層細胞，4度下10 000g 5min離心
6、溶液37度水浴10min以分離水相和去污劑相，然后37度下2 000g離心5min
7、收集水相留作分析
8、用500ul冰冷的buffer C溶解去污劑相沉淀，冰浴2min后加溫，在按步驟6再次離心
9、按步驟8再次抽提去污劑相，用buffer C將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積
10、用等量的buffer A分別稀釋水相與去污相，并進行免疫沉淀實驗 試劑：
1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制劑
2）緩沖液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）
3）buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
10）植物中：高度純化的質(zhì)膜是質(zhì)膜蛋白研究的基礎(chǔ)，制備純化方法也很多，植物材料中以1蔗糖密度梯度離心、2水溶性雙水相法、3自由流電泳等方法為主。前兩種常用。1的產(chǎn)率較高但純度不高，2是20世紀80年代發(fā)展起來的一種分離高純度質(zhì)膜的方法，經(jīng)多次雙水相分配即可得到高純度質(zhì)膜，近些年此方法廣泛用于植物質(zhì)膜的純化。
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